漫画解读：2019诺贝尔生理学奖：面对缺氧，懂得“垃圾分类”的细胞才是好细胞

搞清楚缺氧时细胞里发生的事，能帮我们治疗贫血和癌症

今天，果壳继续带你深入了解细胞是怎样感知并适应环境氧含量的。

当动物细胞周围的氧气水平发生变化时，其基因表达就会发生根本性的变化。基因表达的这些变化会改变细胞代谢，造成组织重建，甚至导致心率和通气量增加等机体反应。

在20世纪90年代初期的研究中，格雷格·塞门扎发现了一种调节这些氧依赖性反应的转录因子，并在1995年纯化和克隆了它。他将这种因子称为HIF，即缺氧诱导因子（Hypoxia Inducible Factor），并证明它由两个部分组成：一个是新发现的，对氧气敏感的部分，HIF-1α；另一个是先前已知的，恒常表达且不受氧调节的蛋白ARNT。小威廉·G·凯林于1995年起从事希佩尔-林道综合征（VHL，von Hipple-Lindau）肿瘤抑制基因的研究，分离出该基因的第一个全长克隆后，他证明，该基因可以抑制VHL突变致瘤细胞系中的肿瘤生长。此后，拉特克利夫爵士于1999年证明了VHL和HIF-1α之间存在相互作用，且VHL调节了HIF-1α的翻译后和对氧敏感的降解。最后，凯林和拉特克利夫爵士的研究组同时发现，VHL对HIF-1α的调节取决于HIF-1α的羟基化，这是一种共价修饰，其本身依赖于氧。

三位获奖者的共同努力证明，基因表达对氧变化的反应与动物细胞中的氧水平直接相关，这使得机体能够通过HIF转录因子的作用，立即发生细胞反应以适应氧合作用。

18世纪70年代初期，瑞典科学家卡尔·舍勒（Carl Scheele）根据计算发现，大约有四分之一的空气是他所说的“火气”，也就是大气中能让物质燃烧的成分。这一发现最终于1777年发表。基本上在同一时间的英格兰，约瑟夫·普里斯特利（Joseph Priestley）也找到了一种净化这种以前未知的气体的方法，他称其为“脱燃素空气”。同一时间，安托万·拉瓦锡（Antoine Lavoisier）在巴黎进行了分离该物质的实验，并且赋予了它我们今天所熟知的名字：氧气。

氧气对于动物的生命是必需的，氧化反应利用氧气使食物中的营养物质转化为腺苷三磷酸（ATP）。确实，根据可利用的氧气量校准细胞条件是控制代谢的关键。早在一个多世纪前，人们就已经发现了这一点，例如，1858年，路易·巴斯德（Louis Pasteur）第一个证明动物细胞中氧气的使用存在复杂的平衡，并且细胞使用多种途径来完成能量转换。75年以前，曾有两项诺贝尔奖与动物的氧感知机制有关：1931年，奥托·沃伯格（Otto Warburg）因其发现涉及细胞呼吸的酶促基础而获奖；1938年，柯奈尔·海门斯（Corneille Heymans）发现了神经系统在对氧气的呼吸反应中的作用。然而，在整个20世纪的大部分时间里，人们都还不清楚在基因表达的水平上，机体是如何调节对氧通量的适应性的。

在几乎所有的动物细胞里，快速应对和适应氧含量变化的能力都是非常必要的。关于演化过程的分子分类学研究清楚表明，当细胞开始将自身组织成多细胞的三维结构时，这种应对氧通量变化的反应，就不再只是单个细胞内代谢适应的自主反应，它还让复杂的生理反应得以发展。细胞需要通过许多自主性途径来适应氧气水平的变化，尤其是通过调节自身的代谢速率。当从组织与器官水平检查这种反应时，科学家发现，多细胞生物需要重塑组织，以适应变化了的氧气水平（例如在创伤后重新构建脉管系统）；也需要调整整个生物体，以补偿氧合作用的变化（例如，运动或者处于高海拔时，通气反应会增加）。

举个例子：当人处于高海拔时，肾脏中有专门的细胞能够感受血液中氧气水平的变化，从而制造和释放促红细胞生成素（EPO）。这种激素可以激活骨髓中的红细胞合成。红细胞浓度增加能够帮助我们适应于更低的氧气分压。

动物可能会暴露于低氧环境，但重要的是，氧气水平在组织中也各不相同。动物组织中的氧气水平在空间上和时间上都有变化；并且，不论是正常的生理事件（例如，骨骼肌用力时，可用的氧气量降低），还是像癌症及感染这样的病理过程，这种变化都会发生。20世纪七八十年代的研究清楚表明，这些局部的、暂时的氧气分压变化，通过改变基因转录，调节细胞和组织中重要的适应反应。这些基因调节反应能够改变细胞代谢，并且控制基础的发育、再生、防御过程，包括血管生成、炎症等许多个方面。

动物细胞感知不同氧气浓度的能力，以及随之而来的对基因表达模式的重塑，对于几乎所有动物的生存都至关重要。由这些途径所控制的氧气激活信号通路，能够影响至少300个分布于各种各样调控网络中的基因。这些分子通路渗透于众多的生理过程之中，从器官发育和代谢稳态，到组织再生和免疫，范围极广；并且，这些通路在许多疾病中都扮演了重要的角色，包括癌症。

任何对动物生命具有深远意义的信号通路，几乎必定会涉及许多层次的精细调节，也必定会拥有许多与其他分子通路的交叉点，氧反应通路也不例外。因此意料之中的是，此次获奖成果在当年发表之后，关于氧反应调控的分子细节也并未就此完结。相反，这几个关键发现打开了整个领域的局面，导致了相关工作的爆炸性发展，揭示了氧通量反应背后的巨大而复杂的分子机制。

三位诺奖获得者的基本发现，都是围绕着缺氧诱导因子（HIF）转录因子的作用展开的。这个因子的发现起源于1986年至1987年间许多人的工作，他们发现，缺氧导致肾脏中的促红细胞生成素（EPO）转录表达增加。而这一发现的根源又可以往上追溯到1882年，法国生理学家保罗·伯特（Paul Bert）首次证明了缺氧会产生心血管效应，也首次证明，暴露在高海拔环境会增加红细胞数量。

一旦人们意识到EPO基因会被缺氧诱导出转录反应，下一步就是确定 EPO 基因调控区中对氧敏感的 DNA 序列是哪一段。格雷格·塞门扎决定用转基因小鼠来寻找EPO 基因的转录调控元件，将人EPO 基因周围不同长短的DNA片段克隆进小鼠体内。他和同事首先证明，一个包含EPO编码序列在内的4000碱基对区域，再加上5'和3'两端的一些短的侧翼序列，能导致所有转进这些基因的组织生产EPO，并引起EPO增加，从而引发红细胞增多症。他们接下来又证明，一个更长的EPO基因结构，其5'端有6000碱基对的侧翼序列，能在肾脏中诱导 EPO 表达。这项研究指出，EPO 对氧气的反应受到复杂的转录调控，其中有正调节因子，也有负调节因子。

仅仅一年后，在1991年，塞门扎就发表了另外两项研究，增加了关于 EPO 基因调控的重要信息。（1）一项DNA水解酶超敏区域的研究找到了 EPO基因 3'端的侧翼序列中的一个小区域，该区域能结合多个核因子，至少有两个核因子能被贫血在肝脏和肾脏中诱导产生；在体外瞬时表达试验中，同样是这个小区域起着缺氧诱导增强因子的作用。（2）另一项研究进一步确定了 EPO 在转基因模型中的转录调控。大约在同一时间，彼得·J·拉特克利夫爵士和杰米·卡罗（Jaime Caro）的实验室的工作表明，EPO基因的3'端存在着起顺式作用的 DNA 元件，该元件转染体外培养的肝癌细胞后，能赋予细胞感受氧气的能力。

上面所说的研究工作指引塞门扎在1992年鉴定出了EPO基因3´端上一段大约有50个碱基对的增强子，在体外培养的细胞中，它可以用来诱导缺氧诱导报告基因的表达。这个增强子，塞门扎称之为缺氧反应元件（HRE），它可结合肝癌细胞中的数种核因子：一个是非诱导性的，另一个则与低氧环境有关。因此，后面的一种因子被塞门扎称为“缺氧诱导因子”（HIF）。

拉特克利夫与塞门扎证实，EPO基因3’端的增强子在很多种类的哺乳动物细胞中都可以驱动缺氧诱导的报告基因表达。这表明，EPO基因相关的供氧调节背后的分子机制在各种各样的细胞中都很活跃，这一发现展现了这种新因子可能是氧含量感知共同的细胞机制中的一部分。

缺氧诱导HIF的过程可以在很多类型的哺乳动物细胞中观察到，而不仅仅是肾脏和肝脏中那些产生促红细胞生成素的细胞。这一点让很多科学家产生了兴趣。HIF的发现提示，代谢适应和响应含氧量变化的组织重构背后可能存在一个通用的分子机制。

此时，塞门扎采取生物化学方法从大量细胞提取物中纯化了这个蛋白质。作为纯化过程中的功能测定，他用“电移位切试验”测试了EPO基因3’端的增强子。纯化蛋白的氨基酸序列分析以及随后的cDNA克隆显示，HIF自身是异源二聚体，由两个不同基因的产物组成。其中第一个成分是HIF因子对氧敏感的部分，被塞门扎命名为HIF-1α；第二部分来自一个恒常表达的基因，一开始它被称为HIF-1b，直到证据显示这个成分其实此前就已经被克隆和描述过，它叫芳香烃受体核转位因子（ARNT）。ARNT蛋白可与其他数种因子结合，而且鉴于它的表达与氧含量无关，很快科学家们便确定HIF-1α是调节HIF氧含量反应性的关键。

一个与HIF-1α高度关联的蛋白于1997年被4个不同研究组独立克隆出来；一开始它有好几个名字，包括至今仍在普遍使用的HIF-2α。不过这个基因的正式定名是EPAS1。EPAS1基因编码一个与HIF-1α有高水平序列同源性的蛋白，并也作为异质二聚体和ARNT结合。它同样有HIF-1α对低氧条件的敏感性，并且本质上和下述HIF-1α有所有相同的调控模式。

然而HIF-1α和EPAS1在功能上有重要差异。删除HIF-1α的小鼠引发了一个明确表型（妊娠中期致死），但删除Epas1基因则会引发多种不同表型，可能是因为遗传背景不同。此外，大量证据表明，有些低氧响应机制是由二者之一单独控制的；例如，红细胞生成主要是由EPAS1控制的。

包括拉特克利夫团队在内，多个实验室获得的数据表明，HIF-1α自身的水平是通过改变蛋白质稳定性实现的，而非通过基因转录改变或蛋白质合成。多个研究组进一步揭示，HIF-1α通过泛素-蛋白酶通路降解，这一方式是氧依赖的。这一工作还发现了HIF-1α的特定结构域是其氧依赖降解的原因（这个结构域简称ODD区，在HIF-1α 和EPAS1中均有表达）。

大约此时——1995年，凯林团队发表了第一个VHL肿瘤抑制基因的全长序列，并证明将一个野生型VHL转入一个肾癌细胞系能阻止细胞系形成肿瘤。凯林和许多其他研究组研究了VHL基因及其与家族癌症易感性的关联。凯林的论文表明，VHL是一种癌症抑制基因，激活这个基因可抑制VHL突变患者的肿瘤生长。1996年，在描述VHL基因的过程中，凯林和马克·戈德伯格（Mark Goldberg）研究组合作证明，多个HIF靶向基因在VHL突变细胞系中过表达。这一发现表明，两种通路（HIF响应和VHL相关肿瘤发生）以某种形式相关。

下一个和VHL功能相关的重要线索是识别出VHL蛋白的结合伴侣。凯林小组和其他研究者在1995年发现，VHL能和转录延伸因子B和C相互作用。1997年，有科学家发现，VHL是一个复合物的成分，该复合物里还有Cul-2蛋白——蛋白质泛素化的一个重要因子。这一发现之后被凯林复现。由于延伸因子C和Cul-2在结构上和Skp1、Cdc53有相似之处，而后两者都已知会针对特定蛋白质造成泛素相关的蛋白质降解，因此这些发现显示出了VHL和蛋白质降解之间的可能联系。

1996~1998年间，人们明确知道了HIF-1α和EPAS1在正常氧浓度下会经由蛋白酶体降解迅速消灭。但是仍然不知道为什么在缺氧条件下这一降解过程会被抑制。拼图缺失的一块在于标记HIF-1α降解的泛素E3连接酶。在这个问题上，拉特克利夫等人于1999年作出了关键的突破，在一篇里程碑式的论文里，他们表明，VHL复合物和HIF-1α的降解相关。接下来，他们和其他人表明，VHL在这一过程中是泛素E3连接酶复合物的识别成分。

拼图最后的重要一片是VHL和HIF-1α的反应以及下一步的HIF-1α分解如何受氧气调控。重要的是，1999年的一篇论文指出，VHL和HIF-1α反应需要有氧和铁存在。这一发现开启了对反应机理的搜索：一方面是HIF-1α要经过怎样的需要氧的化学修饰，才能让VHL结合上去；另一方面是什么酶能催化这一反应。当时，已知在胶原蛋白中会出现需要氧气的蛋白羟基化，并已知受到胶原蛋白脯氨酸-4羟基化酶调控。因此，人们怀疑HIF-1α中脯氨酸基团的羟基化这一需要氧的反应可能会带来VHL结合所需的构象变化。事实也证明如此。2001年，拉特克利夫和凯林的实验室同时汇报，HIF-1α的ODD结构域中两个脯氨酸基团的4-羟基化这一需氧反应增加了VHL复合物对HIF转录因子的亲和度。这两篇文章是几乎同时发表的。

脯氨酸羟基化反应需要氧气，这一事实揭示了HIF-1α和EPAS1蛋白质的翻译后调控机制：缺氧时，不发生羟基化，VHL无法辨认HIF-1α，因此HIF-1α不会被泛素化，从而避免了被蛋白酶体降解，保持完整。结果HIF-1α得以积累，转录激活缺氧诱导的基因α程序（见下图）。

拉特克利夫组和另一个研究组独立确定了参与羟基化HIF-1α和EPAS1的脯氨酰羟化酶（PHD）基因；这些发表于2001年的论文描述了分离PHD基因的过程。凯林小组也分离出PHD基因，但使用的是生物化学方法，并在2002年发表了这项研究。这些羟化酶的鉴定为制造特殊的PHD抑制剂从而增加HIF的活性提供了可能性，例如，增加贫血患者的促红细胞生成素水平。

第二个氧依赖性机制是在2001年发现的，此机制不是为了降解HIF-1α，而是为了抑制HIF-1α作为转录因子的活性。塞门扎和他的团队是第一个识别出相关因子的，将其称为FIH-1，意思是“抑制HIF的因子”。FIH也是一种氧依赖性的羟化酶，这次是负责羟基化HIF-1α和EPAS1的N-末端激活域（NTAD）当中的天冬酰胺残基。有研究者发现，这种羟化作用能干扰p300转录辅助激活因子的募集。这样，氧不仅通过其氧依赖降解域的脯氨酰羟基化促进了HIF-1α降解，如果有HIF-1α或EPAS1躲开了依赖VHL降解的命运，氧依然能抑制它们的转录功能。因此，HIF活性对于氧依赖性转录后抑制不是有一个，而是有两个独立的机制。这表明，通过细胞氧水平调节，保持HIF水平的适当性、准确性是非常精细的过程。

从那以后，许多研究小组的工作显示了HIF通路的坚实作用，以及它在调节受氧影响的基因表达中的核心地位。自从三位获奖者最早的开拓性发现以来，他们一直是这个领域的中心人物。他们参与了HIF通路分子生物学的进一步阐明，并增进了我们对缺氧反应在健康和疾病中所起的生理作用的理解。

调节HIF-1α稳定性的脯氨酸羟化酶被发现后，人们就致力于寻找各种能提高HIF水平的羟化酶抑制剂; 这开辟了一整条药物发现的新通路。事实上，一些通过抑制脯氨酸羟化酶来提高 HIF 功能的潜在药物，已经在临床试验中走得相当远了，最近的一系列论文证明了它们在治疗贫血方面的临床疗效。

抑制HIF通路，未来也可能有很广阔的应用。人们设想，有些癌症是因为VHL突变引起，而抑制 HIF 通路或许能成为延缓这些癌症恶化的手段。其中一种是EPAS1功能的特异性阻断剂，凯林和同事最近报告说，在动物模型中，这能够减缓VHL突变细胞的肿瘤生长。

通过药物提升HIF功能，可能有助于治疗一系列疾病，因为HIF对许多生理过程都必不可少，比如免疫功能、软骨形成和伤口愈合。从反面来说，抑制HIF功能也有许多应用：HIF 水平的增加可见于许多癌症以及一些心血管疾病，包括卒中、心脏病发作和肺部高压。因此，现在很可能只是本届诺贝尔奖发现被应用的开始，因为很明显的事实是，细胞、组织和生物体对氧气的反应，是动物所具有的最重要的生理适应之一。

翻译：八云，麦麦，游识猷，窗敲雨，钟与氏darla，antares，木易杨杨

校对：odette Ent

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