Nature Biotechnology | 李毓龙实验室开发新型催产素荧光探针，揭秘神经肽的时空动态调控
近日，北京大学生命科学学院李毓龙实验室研发了一种新型的荧光探针，可实现体内和体外对胞外催产素的检测，在Nature Biotechnology期刊在线发表了研究成果。团队表示，这一新型成像工具的开发，在分子层面推动了科研人员深入理解神经肽信号传递在生理和病理条件下的功能和调控机理。
以下为李毓龙课题组为果壳撰写的论文解读。
催产素（Oxytocin，OT）是一种由九个氨基酸组成的神经肽，在哺乳动物的内分泌系统和中枢神经系统中发挥着不可或缺的作用。一方面，催产素通过垂体后叶释放进入血液循环，调节分娩和哺乳行为；另一方面，通过胞体树突和投射到其他脑区的轴突末梢释放到大脑中，调节配偶结合、母婴关系和社会认知等重要社会行为。
催产素主要由位于下丘脑室旁核（paraventricular nucleus，PVN）和视上核（supraoptic nucleus，SON）的催产素能神经元合成，并被储存于大致密核心囊泡（large dense-core vesicle，LDCV）中，通过激活G蛋白偶联受体（GPCR）家族的催产素受体（oxytocin receptor，OTR）发挥功能。催产素与其受体（OT/OTR）信号的失调与焦虑等多种负面情绪，以及自闭症和精神分裂症等精神疾病紧密相关。
然而尽管参与上述诸多生理病理过程，发挥重要的调节功能，但催产素在体内释放的时空动态及分子机制尚不明晰，其中主要技术瓶颈在于缺乏灵敏、特异且非侵入式的探针，无法快速准确地追踪其动态变化。
2023年1月2日，北京大学李毓龙实验室在Nature Biotechnology期刊在线发表了题为A genetically encoded sensor measures temporal oxytocin release from different neuronal compartments的研究论文，报道了新型可遗传编码的催产素荧光探针GRABOT1.0的开发及其在活体动物中的应用；结合新的工具，本文同时深入探究了催产素释放的分子机制。
论文截图 | 参考文献[1]
在这一工作中，李毓龙实验室运用GRAB探针策略 (GPCR-Activation Based Sensor)，以催产素受体OTR作为探针识别骨架，将循环重排的绿色荧光蛋白cpGFP嫁接到OTR上，不断筛选优化不同物种来源的OTR和连接肽段，最终基于牛源催产素受体（bovine OTR）开发得到了表现最好的OT荧光探针GRABOT1.0（简称为OT1.0）。
在体外培养细胞和原代神经元中，OT1.0探针的细胞膜定位均表现优异，响应外源催产素迅速，对细胞的正常生理活动没有明显影响。
图1：OT1.0探针在HEK293T细胞和原代培养神经元上的表现。神经元表达的OT1.0探针对外源加入的催产素有~450%的荧光信号响应（ΔF/F0）和约3 nM的表观亲和力（EC50），能够在亚秒级（~0.5s）时间尺度上响应胞外OT浓度变化，且几乎不激活GPCR下游信号通路 | 团队供图
那么OT1.0是否能用于检测内源催产素的释放呢？该团队通过实验证实，探针可成功检测到神经元轴突以及下丘脑释放的催产素。作者将OT1.0探针表达在催产素能神经元轴突投射的中脑腹侧背盖区（ventral tegmental area，VTA），图2所示，成功记录到小鼠急性脑切片中电刺激引起的轴突OT释放，以及下丘脑室旁核（PVN）胞体树突的OT释放。进一步的药理学实验表明，催产素在胞体和轴突末梢的释放依赖截然不同的钙通道。
图2：OT1.0探针在小鼠急性脑切片中检测内源催产素及下丘脑室旁核（PVN）胞体树突释放的催产素 | 团队供图
该团队进一步研究了OT1.0探针在活体动物脑中催产素的动态变化检测，运用光纤记录技术，成功在自由活动的小鼠中检测到OT神经元激活引起的催产素释放，并进一步记录了雄鼠交配过程中各脑区的胞外催产素水平，证实了OT1.0探针在体应用时灵敏度高、信噪比优异并且响应快速。
作为社交行为的关键脑区，前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）大量表达催产素受体，并接受下丘脑中OT神经元的轴突投射。如图3所示，作者借助表达在前额叶皮层的光遗传学工具（ChrimsonR）及OT1.0探针，记录了活体小鼠神经元释放的催产素，还发现交配行为的不同阶段，雄鼠的OT信号在存在脑区特异的动态变化。
图3：OT1.0探针报告自由活动的小鼠在光遗传激活及交配行为时大脑中的催产素信号 | 团队供图
在这项工作中，该团队开发了一种新型遗传编码的催产素荧光探针，高效准确地记录了体外和在体情况下胞外催产素水平，并据此呈现出催产素在两种不同释放模式中的分子机制异同点，有助于进一步理解神经肽功能的复杂性。
值得一提的是，李毓龙实验室一直致力于系统性地发展神经化学分子的检测技术，先后开发了针对胆碱类、单胺类、嘌呤类和脂类神经递质或调质的荧光探针，此次报道的GRABOT1.0是该系列的第一个神经肽类荧光探针，进一步拓展了GRAB荧光探针家族。课题组近期发展的多种神经肽类的GRAB荧光探针还包括促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）、生长抑素（SST）、胆囊收缩素（CCK）,血管活性肠肽（VIP）,神经降压素（NTS）和神经肽Y（NPY）等（Huan Wang, et al. bioRxiv, 2022.）等。
参考文献
[1] Qian, T., Wang, H., Wang, P. et al. A genetically encoded sensor measures temporal oxytocin release from different neuronal compartments. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01561-2
作者：钱统瑞
编辑：靳小明
排版：尹宁流
题图来源：团队供图
研究团队
北京大学生命科学学院李毓龙教授为本文通讯作者；北京大学生命科学学院博士研究生钱统瑞、博士毕业生王欢和首都医科大学附属北京朝阳医院的王鹏博士为本论文的共同第一作者；北京大学博士研究生耿岚、王蕾等对文章做出了重要贡献。该工作得到了北京脑科学与类脑研究中心罗敏敏实验室，美国纽约大学的Dayu Lin实验室，瑞士洛桑大学的Ron Stoop实验室，以及德国海德堡大学的Valery Grinevich实验室的通力合作，并得到了北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、北京市科委、深港脑科学创新研究院、峰基金等机构和经费的大力支持。
更多李毓龙实验室工作详见：http://yulonglilab.org/。
此外，李毓龙实验室诚聘不同学科背景的副研究员、博士后及技术员，待遇从优。欢迎对脑科学感兴趣的有志青年加入！
论文信息
发布期刊Nature Biotechnology
发布时间 2023年1月2日
论文标题 A genetically encoded sensor measures temporal oxytocin release from different neuronal compartments
(DOI：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01561-2）
点击阅读原文即可查看原论文